Основные научные результаты по проекту IN SILICO ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕРАПИИ ОСТРОГО ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА (соглашение № 075-15-2021-950 от 28 сентября 2021 г.)

Соглашение о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий в соответствии с пунктом 4 статьи 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации № 075-15-2021-950 от 28 сентября 2021г

Сроки выполнения проекта: 2021-2023

Отчет представлен за 3 этапа проекта (2021-2023 год)

В ходе выполнения работ I этапа проекта (2021 год) получены следующие результаты
Получателем гранта:
1) Проведены патентные исследования по теме проекта;
2) Проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы по тематике исследования;
3) Разработана in silico модель тромбоза, вызываемого фибриновым тромбом;
4) Разработана in silico модель тромболизиса фибринового тромба;
5) Разработана in silico модель тромболизиса тромба, состоящего из тромбоцитов;
6) Разработана in silico модель тромболизиса тромба, состоящего из фибрина и эритроцитов;
7) Разработана in silico модель тромболизиса тромба, состоящего из тромбоцитов и внеклеточной ДНК;
8) Разработана in silico модель тромболизиса, учитывающую архитектуру тромба, состоящего из регионов, богатых фибрином, тромбоцитами, эритроцитами и внеклеточной ДНК;
9) In silico модель тромболизиса, учитывающая архитектуру тромба, состоящего из регионов, богатых фибрином, тромбоцитами, эритроцитами и внеклеточной ДНК, валидирована на литературных данных. Составлен перечень соответствия результатов моделирования литературным данным, соответствие оценено по качественным критериям. Соответствие модельного описания процесса лизиса и литературных данных об этом процессе можно охарактеризовать как очень хорошее;
10) In silico модель тромболизиса, учитывающая архитектуру тромба, состоящего из регионов, богатых фибрином, тромбоцитами, эритроцитами и внеклеточной ДНК, валидирована на экспериментальных данных. Составлен перечень соответствия результатов моделирования экспериментальным данным, соответствие оценено по качественным критериям. Соответствие модельного описания процесса лизиса и литературных данных об этом процессе можно охарактеризовать как очень хорошее.

Иностранным партнером :

Университет Амстердама, Нидерланды
В ходе выполнения работ I этапа проекта был проведен анализ данных по пациентам с ишемическим инсультом, выявление основных критериев для включения в базу виртуальных пациентов.
Критерии включения пациентов в исследования тромболитических лекарств следующие: 1) Возраст старше 18 лет; 2) балл по модифицированной шкале Ранкина <2 до инсульта (отсутствие значимых нарушений жизнедеятельности, несмотря на имеющиеся симптомы; может выполнять все обычные задачи и сохранять активность); 3) 4-26 баллов по шкале инсульта национального института здоровья на момент попадания в исследование; 4) отсутствие формальных противопоказаний к проведению внутривенной терапии; и 5) адекватный объем гипоперфузируемых, но пригодных для спасения областей головного мозга, рассчитанный с помощью визуализации перфузии (несоответствие между нарушением перфузии и ядром ишемии больше, чем 1,2, абсолютная разница в объеме больше 10 мл и ишемическим ядром меньше 70 мл).
Также, в планы I этапа входила подготовка тромбов к фиксации и получение срезов. После проведения тромбэктомии сгустки фиксировались в формалине и затем помещались в парафин. Парафиновый блок очищался до полноценной визуализации тромба и затем делился на последовательные секции. Таким образом, была получена база образов тромбов для дальнейшего исследования.
Затем производилась гистологическая покраска срезов тромбов и получение микрофотографий. Для этого была разработана специальная процедура покраски. Большинство исследований было сфокусировано на присутствии эритроцитов, фибрина, тромбоцитов и лейкоцитов. Количественное определение состава тромба предпочтительно основывалось на процедурах окрашивания, обладающих хорошей специфичностью к компонентам тромба (фибрину, эритроцитам, тромбоцитам, лейкоцитам). Изображения окрашенных предметных стекол были получены с использованием световой микроскопии. Для выявления различий в содержимом каждого тромба секции анализировались каждые 150-200 мкм в более чем 20 тромбах. Таким образом были получены данные о распределении компонентов внутри тромба.

Университет Женевы, Швейцария
Группа из Швейцарии разработала метод компьютерной реконструкции трехмерного тромба различного состава (фибрин, тромбоциты, эритроциты) из послойных фотографий окрашенных секций тромбов пациентов, с шагом в 5 микрометров. Процедура реконструкции выглядит следующим образом.
Задний план удаляется путем кластерной комбинации цветов пикселей (sklearn Kmeans) и открытием зоны изображения (беглый просмотр морфологии). Каждый пиксель относится к кластеру, определяющему регион тромбоцитов или эритроцитов. Изображения обрезаются до идентичной высоты и ширины. Последовательно обрезанные изображения наконец выстраиваются с использованием преобразования твердого тела (pystackreg). Реконструированные 3D сгустки затем анализируются для определения размеров распределения регионов, богатых тромбоцитами и эритроцитами, для получения более детальной информации об их пространственном распределении. В конечном счете, эти реконструированные тромбы будут «подключены» к симулятору для проведения in silico лизиса сгустков с реалистичным составом. В результате работ были получены трехмерные структуры различных тромбов.

Разработана серия математических моделей, описывающих образование тромба и различные этапы его лизиса. На основе этих моделей создана детальная модель тромболизиса in silico, учитывающая архитектуру тромба, состоящего из регионов, богатых фибрином, тромбоцитами, эритроцитами и внеклеточной ДНК. С помощью этой модели показано, что антифибринолитические свойства внеклеточной ДНК могут быть связаны с тем, что она выполняет структурную функцию, схожую с функцией фибриновой сети, и удерживает от распада как клеточные элементы тромба, так и фибрин или высокомолекулярные продукты его деградации. Использование этой модели может быть полезным как при исследовании механизмов регуляции естественного фибринолиза, так и при оценке эффективности существующих протоколов тромболитической терапии и разработке новых подходов. Поставленные в первый год исполнения проекта задачи выполнены полностью. Полученные результаты моделирования будут включены в методику проведения in silico клинических испытаний подходов для терапии ишемического инсульта на популяции виртуальных пациентов с острым ишемическим инсультом.
При моделировании и валидации моделей были использованы данные ex vivo экспериментов иностранных партнеров. Данные о визуализации состава тромбов пациентов также будут использованы при валидации различных моделей на всех этапах работ по проекту. Также эти данные будут включены в базу данных для создания in silico популяции виртуальных пациентов на 3 этапе.
Для внедрения в широкое использование методики проведения in silico клинических испытаний серия моделей будет расширена на 2 этапе работ: будут разработаны модели, описывающие работу каскада металлопротеиназ; модели по деформируемости разных тромбов; модели тромболизиса в условиях потока жидкости (ньютоновской и неньютоновской); расширена база гистологических срезов тромбов. На 3 этапе будет проведена разработка и оптимизация полномасштабной математической модели, позволяющей проводить клинические испытания in silico на виртуальных пациентах с острым ишемическим инсультом.

В ходе выполнения работ II этапа проекта (2022 год) получены следующие результаты
Получателем гранта:
1) Разработана in silico модель каскада металлопротеиназ внеклкточного матрикса;
2) Разработана in silico модель каскада металлопротеиназ, действующих в кровотоке;
3) Разработана in silico модель, учитывающая изменение активности каскада металлопротеиназ, действующих в кровотоке, при тромболитической терапии;
4) Разработана in silico модель каскада металлопротеиназ, регулирующих гибель и восстановление тканей головного мозга;
5) In silico модели каскада металлопротеиназ валидированы на литературных данных, качественное соответствие модельного описания процесса разрушения и восстановления гемато-энцефалического барьера и тканей головного мозга и литературных данных об этих процессах можно охарактеризовать как хорошее;

Иностранными партнерами (Университет Амстердама, Нидерланды; Университет Женевы, Швейцария)

1) Разработана in silico модель тромболизиса в условиях потока ньютоновской жидкости;
2) Разработана in silico модель тромболизиса в условиях потока неньютоновской жидкости;
3) Разработана in silico модель деформируемости фибринового сгустка;
4) Разработана in silico модель деформируемости тромбоцитарного сгустка;
5) Разработана in silico модель деформируемости сгустка цельной крови;
6) Проведен гистологический анализ тромбов, полученных от пациентов с инсультом;

Полученные результаты работ соответствуют требованиям, изложенным в плане работ научного исследования. В результате выполнения проекта разработана серия математических моделей, описывающих работу каскада металлопротеиназ, действующих как в кровотоке, так и тканях головного мозга и регулирующих целостность ГЭБ и гибель и восстановление тканей. Использование этих моделей может быть полезным как при исследовании механизмов регуляции каскада металлопротеиназ, так и при оценке эффективности существующих протоколов терапии инсульта и разработке новых подходов. Поставленные во второй год исполнения проекта задачи выполнены полностью. Результаты, полученные командами Женевского Университета и Университета Амстердама, будут использованы при создании модели тромбоза, необходимой на 3 этапе работы по проекту. Они будут включены в методику проведения in silico клинических испытаний подходов для терапии ишемического инсульта на популяции виртуальных пациентов с острым ишемическим инсультом.
На 3 этапе будет проведена разработка и оптимизация полномасштабной математической модели, позволяющей проводить клинические испытания in silico на виртуальных пациентах с острым ишемическим инсультом. В ходе выполнения работ III этапа проекта получены следующие результаты:

1) Проведены дополнительные патентные исследования по теме проекта;
2) Проведены in silico клинические испытания существующих подходов в терапии ишемического инсульта на популяции виртуальных пациентов (тромболитическая терапия) и сравнение с литературными данными об эффективности стандартной терапии, результаты этого сравнения можно характеризовать как отличные;
3) Проведены in silico клинические испытания новых подходов в терапии ишемического инсульта на популяции виртуальных пациентов;
4) Разработана in silico модель кровообращения в мозге при тромбообразовании во внутренней сонной артерии;
5) Разработаны рекомендации и предложения по использованию результатов исследования; 6) Проведена технико-экономическая оценка результатов исследования;


Иностранными партнерами (Университет Амстердама, Нидерланды; Университет Женевы, Швейцария)

1) Разработана in silico популяция виртуальных пациентов;
2) Сконструированы in vitro тромбы с различным составом и проведен их лизис;
3) Разработана редуцированная, эффективная в вычислительном плане модель тромболизиса, описывающей различные режимы лизиса тромбов;

Полученные результаты работ соответствуют требованиям, изложенным в плане работ научного исследования. В результате выполнения проекта разработана методика, позволяющая проводить in silico клинические испытания терапии ишемического инсульта на популяции виртуальных пациентов. Проведена технико-экономическая оценка результатов исследования и составлены рекомендации по их применению.

Результаты, полученные командами Женевского Университета и Университета Амстердама, были использованы для создания и валидации отдельных элементов программного комплекса, использующегося при проведении in silico клинических испытаний на популяции виртуальных пациентов.